PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) w raku jelita grubego

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) w raku jelita grubego

Martyna Bednarczyk(1), Natalia Krajewska(2), Katarzyna Walkiewicz(1), Paweł Kozieł (1), Urszula Mazurek(3), Małgorzata Muc-Wierzgoń (1),

(1)Wydział Zdrowia Publicznego w Bytomiu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Katedra Chorób Wewnętrznych, ul. Żeromskiego 7, 41-902 Bytom
(2)Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Katedra Analizy Instrumentalnej, ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec
(3)Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec

STRESZCZENIE

Białko PINK1 (ang. PTEN-induced putative kinase 1) jest mitochondrialną kinazą serynowo – treoninową. Znajduje się w mitochondriach wszystkich komórek organizmu. Jego zadaniem jest ochrona komórek przed stresem indukowanym zaburzeniem mitochondriów. Wraz z parkiną bierze udział w regulacji morfologii i dynamiki mitochondriów, poprzez oddziaływanie z białkami zarządzającymi procesami mitochondrialnej fuzji i podziału.

Celem badania było określenie profilu ekspresji genu PINK1 biorącego udział w mitofagii w raku jelita grubego o różnym stopniu zaawansowania.

Analizę profilu ekspresji genów wykonano przy użyciu mikromacierzy of HG-U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA). Typowanie genów różnicujących przeprowadzono z wykorzystaniem Infrastruktury PL-Grid.

Analizując aktywność transkrypcyjną mRNA PINK1 stwierdzono, że gen kodujący to białko wykazuje zmniejszoną ekspresję w kontroli K2 i gruczolakoraku jelita grubego, zależnie od stopnia zaawansowania, p < 0,05. Wartość parametru FC – wskazującego log2 różnicy sygnałów fluorescencji pomiędzy porównywanymi grupami wynosiła K2 vs K = - 1.0811611 oraz NSZ vs K = -2.0804248 i WSZ vs K = -1.8020356.

Wnioski: Podobieństwo grupy K2 do grupy gruczolakoraka potwierdza, że zmiany molekularne wyprzedzają zmiany fenotypowe. W grupie kontrolnej K2 mogą znajdować się już komórki nowotworowe. Zmniejszenie aktywności transkrypcyjnej genu PINK1 tylko nieznacznie zależy od stopnia zaawansowania gruczolakoraka.

1. WSTĘP

Mitochondria są endosymbiotycznymi organellami pochodzącymi od prymitywnych bakterii tlenowych [1]. Otoczone są podwójną błoną, składającą się z zewnętrznej (OMM) oraz wewnętrznej błony mitochondrialnej (IMM). Zajmują ok. 10-40% objętości komórkowej [2].

Mitochondria są organellami istotnymi dla prawidłowego funkcjonowania komórek oraz ich żywotności. Mają również duże znaczenie w wielu procesach zachodzących w organizmie, takich jak produkcja energii (ATP), metabolizm komórkowy, tumorogeneza, buforowanie wapnia czy udział  w programowanej śmierci komórki. Organella te są bardzo dynamiczne, mają możliwość ciągłego przemieszczania i zmiany kształtu [2, 3].

Uszkodzone mitochondria mogą być sygnałem do śmierci komórki, zapalenia lub starzenia. Zwiększony poziom dysfunkcyjnych mitochondriów może uczestniczyć w patogenezie wielu chorób [2]. Akumulacja uszkodzonych mitochondriów przyczynia się przede wszystkim do starzenia komórek, co najprawdopodobniej jest wynikiem nagromadzenia reaktywnych form tlenu (ROS), indukujących mutacje w mtDNA. Proces odpowiadający za usuwanie uszkodzonych mitochondriów to mitofagia, gdzie autofagosom pochłania uszkodzone organella, kierując je na drogę degradacji lizosomalnej [3, 4]. Mitofagia aktywowana jest w odpowiedzi na niedotlenienie, uszkodzenie mitochondriów czy niedobór substratów tlenowych w wielu typach komórek [5]. Utrzymuje równowagę pomiędzy biogenezą organelli, syntezą białka a degradacją składników komórkowych. Mitofagię poprzedza utrata potencjału błony mitochondrialnej oraz fragmentacja mitochondriów. Zgodnie z aktualnymi doniesieniami, mitochondrialna depolaryzacja przyczynia się do aktywacji mitofagii zależnej od Parkiny, przez indukcję kinazy PINK1 (ang. PTEN-induced kinase 1) w OMM [3, 6].

PINK1 jest białkową kinazą mitochondrialną serynowo – treoninową o masie 63kDa. Składa się z 581 aminokwasów. W swojej budowie zawiera N-końcową mitochondrialną sekwencję kierującą oraz C-końcową domenę autoregulacyjną [5]. Jest kluczowym białkiem neuroprotekcyjnym, mającym na celu zapobieganie uszkodzeniu mitochondriów oraz śmierci apoptotycznej komórek w odpowiedzi na czynniki stresowe [7]. Ponadto kinaza PINK1, wraz z Parkiną (ligaza ubikwityny E3) pełnią główną rolę w regulacji mitofagii.

W spolaryzowanych mitochondriach poziom PINK1 jest bardzo niski, aby zapobiec mitofagii zdrowych mitochondriów. Natomiast podczas depolaryzacji mitochondriów, PINK1 szybko ulega akumulacji w uszkodzonych organellach, przekracza OMM oraz działa jako czujnik komórkowy uszkodzonych mitochondriów. W spolaryzowanych mitochondriach, PINK1 zostaje importowany do mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, gdzie ulega degradacji przez proteazy PARL (ang. presenilinassociated rhomboid-like protein), tym samym utrzymując niski poziom PINK1 w normalnych warunkach. Depolaryzacja mitochondriów dezaktywuje proteasomalną degradację, prowadząc do akumulacji PINK1 w OMM. PINK1 następnie rekrutuje Parkinę do powierzchni mitochondriów o niskim potencjale błonowym. Następuje aktywacja enzymu E3 w celu ubikwitynacji niektórych białek obecnych w OMM, co z kolei powoduje rekrutację kolejnych białek, odpowiadających za inicjację mitofagii, prowadzącej do usuwania uszkodzonych mitochondriów [2, 3].

Rys.1. Schemat procesu mitofagii [Sureshbabu 2013]

Celem niniejszego badania było porównanie profilu stężeń mRNA PINK1 w różnych stopniach zaawansowania raka jelita grubego z kontrolą oraz ocena zgodności grupowania wycinków jelita w zależności od przyjętego kryterium - analizy histopatologicznej, klinicznej i molekularnej.

2. MATERIAŁY I METODY

Analizie poddano wycinki gruczolakoraka jelita grubego oraz wycinki tkankowe pobrane z jelita prawidłowego. Podczas zabiegu operacyjnego uzyskano materiał obejmujący tkankę guza oraz margines wynoszący 5 cm. Margines został oceniony makroskopowo i histopatologicznie jako jelito zdrowe. Następnie do analizy molekularnej typowano 35 wycinków jelita grubego, z czego 17 na podstawie analizy histopatologicznej oceniono jako jelito prawidłowe (kontrola), a pozostałe jako gruczolakorak w różnych stopniach zaawansowania (CSI-3, CSII-5, CSIII-6, CSIV-14).

Pierwszym etapem doświadczenia była homogenizacja dostarczonego materiału z wykorzystaniem homogenizatora Polytron (Kinematyka, AG, Szwajcaria). Następnie za pomocą odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Kalifornia, USA) wyizolowano całkowite RNA, zgodnie z zaleceniem producenta. Wyizolowane RNA oczyszczono na kolumienkach zestawu RNeasy Mini Kit firmy Qiagen w połączeniu z trawieniem DNazą I.

Następnie RNA poddano ocenie ilościowej i jakościowej. Za pomocą spektrofotometru GeneQuant II wyznaczono stężenie RNA na podstawie wartości absorbancji przy długości fali 260 nm. Ponadto przeprowadzono elektroforezę w 1% żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny.

Aktywność transkrypcyjną genu PINK1 wyznaczono techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HGU-133A (Affymetrix), zgodnie z zaleceniami producenta. Procedurę rozpoczęto od syntezy cDNA na oczyszczonej matrycy RNA zgodnie z protokołem Gibco, BRL SuperScript Choice System. Otrzymany cDNA stanowił matrycę do zsyntetyzowania wyznakowanego biotyną cRNA, który poddano fragmentacji cRNA z zastosowaniem Sample Cleanup Module Kit (Qiagen GmbH, Germany). W kolejnym etapie przeprowadzono hybrydyzację cRNA ze specyficznymi sondami na mikromacierzy HGU-133A (Affymetrix). Otrzymane produkty wyznakowano kompleksem sreptawidyna-fikoerytrynasygnały fluorescencjo odczytano w skanerze GeneArray Scanner G2500A (Affymetrix).

Analiza otrzymanych wyników prowadzona była za pomocą Infrastruktury PL-Grid (http://www.plgrid.pl/) oraz programu Statistica 12.0. W analizie statystycznej zastosowano poziom istotności statystycznej wynoszący p(α)<0,05. Dla każdego analizowanego parametru wyznaczono najważniejsze elementy statystyki opisowej: średnią, medianę, wartość minimalną i maksymalną, odchylenie standardowe oraz kwartyl górny (75%) i dolny (25%).

3. WYNIKI

Pierwszym etapem było przeprowadzenie grupowania hierarchicznego z miarą Czebyszewa w celu oceny stopnia zróżnicowania transkryptomów. Grupowanie przeprowadza się, aby porównać zgodności grupowania wycinków w zależności od stopnia zaawansowania raka jelita grubego wyznaczonego na podstawie analizy histopatologicznej, klinicznej oraz molekularnej.

Transkryptomy zostały podzielone na cztery grupy: dwie charakterystyczne były dla raka jelita grubego NSZ (CSI) – niski stopień zaawansowania i WSZ (CSII, CSIII, CSIV) – wysoki stopień zaawansowania oraz dwie grupy kontrolne (K1 i K2). Co więcej, grupa K2 wykazywała podobieństwo do raka w wysokim stopniu zaawansowana.

Rys. 2. Dendrogram obrazujący wyniki grupowania hierarchicznego profili znormalizowanego poziomu sygnałów fluorescencji 22283 ID mRNA w transkryptomach wyznaczonych metodą mikromacierzy oligonukleotydowych HGU-133A

Na podstawie powyższego dendrogramu stwierdzono, że grupowanie hierarchiczne na podstawie analizy histopatologicznej nie do końca się pokrywa z grupowaniem na podstawie analizy molekularnej. Podstawową różnicą jest to, iż w grupie transkryptomów NSZ znajduje się wycinek K1, zakwalifikowany na podstawie analizy molekularnej do grupy kontrolnej, co wskazuje na to, że mógł już się rozpocząć proces transformacji nowotworowej. Ponadto w grupie WSZ obecne są wymieszane transkryptomy, oznaczone jako CS-II, CS-III i CS-IV.

Analizę profili stężeń ID mRNA genu kodującego PINK1 rozpoczęto od oceny rozproszenia sygnałów fluorescencji mRNA PINK1 w badanych wycinkach jelita grubego, w oparciu o statystyki opisowe. W analizie statystycznej zastosowano ogólnie przyjęty w badaniach medycznych poziom istotności statystycznej p(α)<0,05. Wyznaczono podstawowe elementy statystyki opisowej: średnią z odchyleniem standardowym (Rys. 3). Otrzymane wyniki potwierdziły, że wartości sygnałów fluorescencji tylko w niewielkim stopniu zmieniają pomiędzy wycinkami z grupy NSZ a WSZ.

Rys. 3. Statystyki opisowe przedstawiające zróżnicowanie aktywności transkrypcyjnej dwóch izoform genu PINK1 w zdrowych wycinkach jelita grubego oraz w gruczolakoraku w niskim i wysokim stopniu zaawansowania

Rys. 3. Kontynuacja

Wielkość i znamienność statystyczną zróżnicowania grup mRNA analizowano wykorzystując kolejne testy w programie PL-Grid, przystosowanym do analizy mikromacierzy ekspresyjnych Affymetrix.

Wyniki dla genu PINK1 przedstawia tabela 1. Wartość p oznacza dopuszczalne, maksymalne prawdopodobieństwo wystąpienia określonej zmiany, natomiast parametr FC (ang. Fold Change) wskazuje log2 wielokrotności różnicy sygnałów fluorescencji mRNA różnicujących wycinki raka jelita grubego K2, NSZ i WSZ od kontroli K1. Ponadto w oparciu o parametr FC, zostały wyznaczone kierunki obserwowanych zmian: zmniejszenie poziomu mRNA (obniżona ekspresja) lub zwiększenie poziomu mRNA (nadekspresja). Na podstawie otrzymanych wyników zaobserwowano obniżenie aktywności transkrypcyjnej PINK1 w komórkach rakowych w porównaniu do kontroli. Ponadto przedstawione poniżej wyniki wskazują, że wraz ze wzrostem zaawansowania gruczolakoraka jelita grubego, zwiększa się aktywność transkrypcyjna genu PINK1, co może sugerować hamowanie proliferacji komórek nowotworowych.

Tabela 1. Wynik analizy wskazującej znamienność statystyczną różnicy poziomu mRNA PINK1 w wycinkach gruczolakoraka jelita grubego w odniesieniu do kontroli p < 0,05  

4. DYSKUSJA

Rak jest jedną z chorób, wynikającą z nieprawidłowej sygnalizacji w systemach komórkowych związanych przeżyciem oraz śmiercią. Wynika z tego, że deregulacja procesów molekularnych, takich jak naprawa uszkodzeń DNA, wewnątrzkomórkowy bilans energetyczny oraz system transdukcji sygnału, może indukować powstawanie guzów [8]. Zgodnie z prowadzonymi w ostatnich latach badaniami, mitofagia ma kluczowe znaczenie w patogenezie chorób nowotworowych z uwagi na fakt, iż podczas progresji guza następuje akumulacja uszkodzonych mitochondriów [6, 9].

Do tej pory nie ma zbyt wielu danych na temat udziału białka PINK1 w rozwoju raka jelita grubego, wiadomo jednak iż przyczynia się do indukcji wielu typów nowotworów. Według danych literaturowych, PINK1 jest jednym z genów mający działanie zarówno onkogenne, jak i supresorowe. Ostatnie badania wykazały, że PINK1 jest pozytywnym regulatorem progresji cyklu komórkowego, dzięki czemu może promować fenotyp związany z rakiem. Ponadto uważany jest za główne mitochondrialne białko kontroli jakości, uczestniczące w regulacji rozszczepiania i fuzji mitochondriów oraz wcześniej wspomnianej mitofagii. PINK1 ma kluczowe znaczenie w przebiegu cyklu komórkowego w punktach kontrolnych G2/M oraz G0/G1, niezbędnych do podziału komórki, wzrostu, odporności na stres, w szczególności w biologii nowotworów. Co za tym idzie, delecja PINK1 hamuje proliferację, tworzenie kolonii, migrację oraz potencjał inwazyjny komórek nowotworowych [8].

W niniejszym badaniu porównano aktywność transkrypcyjną białka PINK1, biorącego udział w regulacji mitofagii w gruczolakoraku jelita grubego o różnym stopniu zaawansowania z  jelitem niezmienionym chorobowo (kontrola). Wyniki przedstawione w postaci parametru Fold Change sugerują, że PINK1 ulega wyciszeniu w raku w porównaniu z kontrolą, a jego ekspresja w niewielkim stopniu zależy od stopnia zaawansowania choroby.

Ponadto przedstawiony schemat grupowania hierarchicznego wskazuje, że zmiany molekularne wyprzedzają zmiany fenotypowe. Zjawisko to może być wykorzystane do potwierdzenia radykalności zabiegu operacyjnego.

PINK1 może być wykorzystany jako potencjalny cel w leczeniu nowotworów. Zmniejszenie ekspresji tego genu ogranicza proliferację oraz hamuje podział komórek, co za tym idzie może być bezpośrednim blokerem cyklu komórkowego w nowotworach. Ponadto niezdolność komórek do podziału w przypadku niedoboru PINK1 powoduje wzrost aberracji chromosomowych, genetyczną niestabilność czy aneuploidię, co może prowadzić do rozwoju raka [8].

Co ważne, utrata białka PINK1 lub Parkiny upośledza proces mitofagii i powoduje zaburzenia mitochondrialne. Ponadto uważa się, że PINK1 pełni również rolę w autofagii indukowanej stresem. Utrata tego białka powoduje zmniejszenie ekspresji kluczowych genów zaangażowanych w autofagię, w tym BECN1 oraz LC3. Najnowsze badania wykazują, że zachodzą interakcje pomiędzy PINK1 a Bekliną i LC3 na poziomie białka, natomiast badania przeprowadzone w przyszłości mogą rozszerzyć te interakcje na poziomie genetycznym. W związku z tym, spadek ekspresji PINK1 koreluje ze zmniejszenie aktywności LC3-II, podczas gdy nadekspresja PINK1 zwiększa poziom LC3-II [10].

W ostatnich latach prowadzono wiele badań molekularnych skupiających się na poszukiwaniu nowych, skutecznych metod terapii gruczolakoraka jelita grubego. Kluczowe znaczenie w rozwoju medycyny ma zrozumienie podstaw molekularnych powstawania nowotworów oraz identyfikacja biomarkerów związanych z powstawaniem choroby. Naukowcy starają się opracować terapię działającą bezpośrednio na guz. W związku z tym badane są wciąż nowe szlaki sygnałowe, uczestniczące w przekształceniu normalnej błony śluzowej jelita grubego w tkankę nowotworową [11]. Jednak pomimo wysiłków ostatnich lat, rokowania nadal są słabe. Średnia długość życia od wykrycia choroby wynosi mniej niż 2 lata. Dlatego istotne jest, głębsze zrozumienie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w patogenezę raka jelita grubego oraz doskonalenie technik molekularnych zaangażowanych w projektowanie nowych leków. Obszar ten jednak nadal wymaga dalszych badań [12, 13].

Podsumowując, uważa się że PINK1 pełni ważną rolę w proliferacji oraz przerzutach komórek nowotworowych jelita grubego. Wyniki niniejszego badania wskazują na zmniejszenie mRNA PINK1 w komórkach gruczolakoraka jelita grubego w porównaniu do komórek kontrolnych, a jego ekspresja tylko w niewielkim stopniu zależy od stopnia zaawansowania, przy czym aktywność transkrypcyjna jest wyższa w tkankach NSZ niż w WSZ. Innymi słowy poziom mRNA PINK1 wzrasta wraz ze stopniem zaawansowania choroby. Wyniki niniejszego badania pokrywają się z danymi literaturowymi, z uwagi iż zmniejszenie aktywności transkrypcyjnej hamuje podział komórek nowotworowych, a co za tym idzie rozwój choroby. Konieczne jednak są dalsze badania na poziomie molekularnym w tym kierunku, które pomogą określić związek białka PINK1 z progresją nowotworu oraz zidentyfikować ścieżki sygnałowe, przyczyniające się do rozwoju choroby.

5. WNIOSKI

•    Wraz ze zwiększeniem stopnia zaawansowania raka, poziom mRNA PINK1 wzrasta
•    Zmniejszona ekspresja w porównaniu do kontroli wskazuje, że wraz z transformacją nowotworową komórki tracą zdolność do mitofagii
•    Zmniejszenie ekspresji BECN1 może oznaczać zahamowanie podziałów komórek nowotworowych

LITERATURA

[1]    Chen Y, Dorn G, PINK1-phosphorylated mitofusin 2 is a Parkin receptor for culling damaged mitochondria, 2013, Science, 471-475
[2]    Hamacher-Brady A, Brady N, Mitophagy programs mechanisms and physiological implications of mitochondrial targeting by autophagy, 2016, Cellular and Molecular Life Sciences, 775-795
[3]    Cavallucci V, Bisicchia E, Cencioni M i in, Acute focal brain damage alters mitochondrial dynamics and autophagy in axotomized neurons, 2014, Cell Death and Disease, 1-12
[4]    Shirihai O, Song M, Dorn G, How mitochondrial dynamism orchestrates mitophagy, 2015,Circulation Research, 1835-1849
[5]    Chu C, Tickled PINK1 mitochondrial homeostasis and autophagy in recessive Parkinsonism, 2010, Biochimica et Biophysica Acta, 20-28
[6]    Chourasia A, Boland M, Macleod K, Mitophagy and cancer, 2015, Cancer & Metabolism, 2-11
[7]    Arena G, Gelmetti V, Torosantucci L i in, PINK1 protects against cell death induced by mitochondrial depolarization, by phosphorylating Bcl-xL and impairing its pro-apoptotic cleavage, 2013, Cell Death and Differentiation, 920-930
[8]    O'Flanagan C, Morais V, O’Neill C, PINK1, cancer and neurodegeneration, 2016, Oncoscience, 1-2
[9]    Mizumura K, Cloonan S, Nakahira K i in, Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD, 2014, The Journal of Clinical Investigation, 3987-4003
[10]    Parganlija D, Klinkenberg M, Domingues-Bautista J, i in, Loss of PINK1 impairs stress-induced autophagy and cell survival, 2014, PLOS ONE, e95288
[11]    Yan Y, Grothey A, Molecular profiling in the treatment of colorectal cancer focus on regorafenib, 2015, Oncotargets and Therapy, 2949-2957
[12]    Grande M, Milito G, Attina G i in, Evaluation of clinical, laboratory and morphologic prognostic factors in colon cancer, 2008, World Journal of Surgical Oncology, 1-7
[13]    Grande-Pulido E, Riquelme-Oliveira A, Ballesteros-Bargues J i in, Molecular biology of colorectal cancer, 2011, The Challenge of Colorectal Cancer, 35-51

 

 

 

 

Sponsor:

CookiesAccept

UWAGA! Ten serwis używa cookies i podobnych technologii.

Brak zmiany ustawienia przeglądarki oznacza zgodę na to. Czytaj więcej…

Zrozumiałem

Free Joomla! template by Age Themes