Badania właściwości antymikrobiologicznych kremu z dodatkiem olejku goździkowego metodą krążkowo-dyfuzyjną

Edyta Makuch⁽¹⁾, Agnieszka Wróblewska⁽¹⁾, Agata Markowska-Szczupak⁽²⁾, Łukasz Kucharski⁽³⁾, Adam Klimowicz⁽³⁾

⁽¹⁾ Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Wydział Technologii
i Inżynierii Chemicznej, Instytut Technologii Chemicznej Organicznej, ul. Pułaskiego 10,
70-322 Szczecin
⁽²⁾ Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Wydział Technologii
i Inżynierii Chemicznej, Instytut Technologii Chemicznej Nieorganicznej i Inżynierii Środowiska, ul. Pułaskiego 10, 70-322 Szczecin
⁽³⁾ Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Wydział Nauk o Zdrowiu, Katedra i Zakład Chemii Kosmetycznej i Farmaceutycznej, ul. Powstańców Wielkopolskich 72,
70-111 Szczecin

STRESZCZENIE

Celem pracy było przeprowadzenie wstępnej oceny przeciwdrobnoustrojowej olejku goździkowego wyodrębnionego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego (pochodzących z Indonezji - Azja Południowo-Wschodnia), metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta. Badania wyodrębnionego olejku eterycznego prowadzono wobec bakterii gram ujemnych (Escherichia coli), bakterii gram dodatnich (Staphyloccocus epidermidis) oraz grzybów drożdżopodobnych (Candida  albicans) i pleśniowych (Penicillium chrysogenum, Aspergilllus niger) za pomocą metody krążkowo-dyfuzyjnej.

Ponadto przeprowadzono również badania czystości mikrobiologicznej dla próbek kremu zawierającego różne ilości olejku goździkowego. Czystość określano w trzech odstępach czasowych: w pierwszym tygodniu po wytworzeniu próbek kremu, po 3 miesiącach i po 12 miesiącach. W ten sposób sprawdzano stabilność mikrobiologiczną uzyskanych produktów.

 

1. WSTĘP

Olejek goździkowy (Oleum Caryophylli) pozyskiwany jest z pąków kwiatowych drzewa goździkowca wonnego (Eugenia cariophyllata), pochodzącego z rodziny mirtowatych (Myrtaceae), które rośnie w krajach podzwrotnikowych, takich jak: Filipiny, Indonezja (wyspy korzenne Maluku), Tanzania (wyspa Zanzibar) oraz w Indiach (wyspy Seszele). Olejek ten, charakteryzujący się lekko brązowym zabarwieniem, posiada korzenny zapach i piekący smak, stąd już w starożytności znalazł on zastosowanie jako przyprawa. Drzewo goździkowca owocuje dopiero po około 10-ciu latach, wytwarzając pąki koloru różowego, które po wysuszeniu przyjmują barwę rdzawobrązową. Nazwa goździk wywodzi się od słów eugenia i caryophyllatus nawiązujących do orzechopodobnego wyglądu pąków kwiatowych. Zawartość olejku goździkowego w materiale roślinnym wynosi od 19 do 25%, natomiast jego głównym składnikiem jest eugenol (4-allilo-2-metoksyfenol). Obok eugenolu w olejku goździkowym mogą również występować inne związki terpenowe, takie jak: kariofilen (2-metyleno-6,10,10-trimetylo-bicyklo-[7,2,0]-imdec-5-en), α-pinen (2,6,6-trimetylo-bicyklo-[3,1,1]-hept-2-en), ß-pinen (6,6-dimetylo-2-metylenobi-cyklo-[3,1,1]-heptan) oraz limonen (4-izopropenylo-1-metylocykloheksen) [1-5].       

Ze względu cenne właściwości, które wykazuje ten olejek, znalazł on zastosowanie w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym, kosmetycznym oraz w stomatologii. Stosowany jest on między innymi: w terapii zakażeń górnych dróg oddechowych i przewodu pokarmowego, w reumatyzmie, w artretyzmie czy w nerwobólach. Ponadto olejek goździkowy stosowany jako repelent, który skutecznie odstrasza owady, a także łagodzi skutki ich ukąszeń. Olejek goździkowy jest składnikiem: preparatów ziołowych (Olbas oil, Aromatol, Salviasept, Olbas pastilles, Argol, Noval i Mellisana closterfrau), past stosowanych do wypełnień kanałów zębów (Endomethazone N, Caryosan, Endomethazone, Hermetic i Endopur), past mumifikacyjnych, cementu tlenkowo-cynkowo-eugenolowego, stosowanego do wypełnień czasowych ubytków próchnicowych zębów, cementów chirurgicznych, preparatów stosowanych w chorobach przyzębia, płukanek ziołowych stosowanych do płukania jamy ustnej i gardła oraz maści rozgrzewających i przeciwbólowych [3-10].

Z doniesień literaturowych wynika, że olejek goździkowy wykazuje aktywność wobec bakterii beztlenowych, jak i bakterii tlenowych. W opisanych w literaturze badaniach wykazano aktywność olejku goździkowego wobec następujących bakterii gram-ujemnych: a) jelitowych bakterii posiadających kształt pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae (gatunek: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes, Klebsiella ozaenae, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Salmonella typhi, Salmonella dysenteriae), b) bakterii z rodziny Vibrionaceae (gatunek: Vibrio cholerae), c) bakterii z rodziny Listeriaceae (gatunek: Listeria monocytogenes), d) bakterii żyjących głównie w glebie i wodzie oraz na powierzchni roślin z rodziny Pseudomonadaceae (gatunek: Pseudomonas aeruginosa), e) jelitowych bakterii z rodziny Fusobacteriaceae (gatunek: Fusobacterium nucleatum), f) bakterii z rodziny Porphyromonas (gatunek: Porphyromonas gingivalis), g) bakterii z rodziny Prevotellaceae (gatunek: Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica), h) bakterii z rodziny Pasteurellaceae gatunek: Aggregatibacter actinomycetemcomitans) oraz i) Flavobacteriaceae (gatunek: Capnocytophaga gingivalis) [6-12].

Ponadto olejek goździkowy wykazuje również aktywność wobec: a) pałeczkowatych bakterii gram-dodatnich bytujących w jelicie grubym większości ssaków, w tym ludzi z rodziny Bifidobacteriaceae (gatunek: Bifidobacterium inopinatum, Bifidobacterium denticolens, Bifidobacterium dentium) oraz b) bakterii gram-dodatnich należących do gronkowców z rodziny Staphylococcaceae (gatunek: Staphylococcus aureus) [7-14].

Istnieje wiele publikacji opisujących działanie przeciwdrobnoustrojowe olejku goździkowego, jednak opisane w literaturze badania skupiają się głównie na aktywności czystego olejku goździkowego wobec bakterii: beztlenowych i tlenowych. A przecież wiele kosmetyków, ze względu na swój skład (np. hydrolizaty białkowe, węglowodany itp.) stanowi bardzo dobre podłoże dla rozwoju mikroorganizmów. Z kolei, obecność bakterii, grzybów drożdżopodobnych i pleśniowych w kosmetykach i preparatach leczniczych może spowodować wiele niekorzystnych zmian we właściwościach i w oczekiwanym działaniu kosmetycznym i leczniczym. Dokonuje się to na kilka różnych sposobów: 1) poprzez zmiany zachodzące we właściwościach fizykochemicznych, 2) w wyniku pogorszenia jakości estetycznej, 3) poprzez biodegradację aktywnych składników, a nawet 4) w wyniku pojawienia się nowych, niepożądanych metabolitów takich jak toksyny [1,2,15]. W opisach literaturowych brakuje więc szerszych informacji dotyczących działania przeciwbakteryjnego i przeciwgrzybowego gotowych kosmetyków zawierających w różnym stężeniu olejek goździkowy.

Celem pracy była ocena aktywności wobec bakterii i grzybów drożdżopodobnych i pleśniowych próbek kremu zawierających różne ilości olejku goździkowego wyodrębnionego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta.

2. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA I WYNIKI

2.1. Otrzymywanie olejku goździkowego (Oleum Caryophylli)

W pierwszej kolejności przeprowadzono wyodrębnianie olejku goździkowego z materiału roślinnego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, stosując 10 g całych pąków kwiatowych goździkowca korzennego oraz 200 cm³ wody dejonizowanej. Zebrany w kolbie okrągłodennej destylat odwirowywano na wirówce, w celu uzyskania jego rozdziału na dwie warstwy: 1) dolną - organiczną, zawierającą, jako główny składnik olejek goździkowy oraz 2) górną - wodną.

W kolejnym etapie badań pobrany za pomocą strzykawki olejek goździkowy osuszano na sitach molekularnych o wielkości 4 Å, w celu zaadsorbowania cząsteczek wody znajdujących się w olejku. Następnie oznaczano skład jakościowy olejku goździkowego metodą chromatografii gazowej na aparacie FOCUS z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID), przy zastosowaniu kolumny kapilarnej ZEBRON ZB-WAXplus z wypełnieniem w postaci glikolu polietylenowego i autosamplera.

Na Rysunku 1 przedstawiono chromatogram olejku goździkowego wyodrębnionego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego (pochodzących z Indonezji - Azja Południowo-Wschodnia) metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz eugenolu (wzorzec, Sigma-Aldrich), będącego głównym składnikiem tego oleju.

Rys. 1. Chromatogram olejku goździkowego wyodrębnionego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego (pochodzących z Indonezji - Azja Południowo-Wschodnia) metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz jego wzorzec (eugenol)

2.2. Ocena aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybowej olejku goździkowego

Ocenę aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybowej olejku goździkowego wyodrębnionego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta przeprowadzono za pomocą metody krążkowo-dyfuzyjnej.

W badaniach wykorzystano następujące mikroorganizmy: a) bakterie gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae, gatunek Escherichia coli K12 (ATC2952), b) bakterie gram-dodatnie z rodziny Staphylococcaceae, gatunek Staphyloccocus epidermidis (ACCT 49461), c) drożdżaki z rodziny Incertae sedis, gatunek Candida albicans Ca2 (szczep wyizolowany od pacjenta z obniżoną odpornością) oraz d) grzyby pleśniowe z rodziny Trichocomaceae, gatunek Penicillium chrysogenum AMS1 i Aspergilllus niger (szczepy wyizolowane z powietrza klubu fitness).

Dwudziestoczterogodzinne hodowle bakterii i grzybów rozcieńczano w płynie fizjologicznym (0,9% NaCl) do gęstości 0,5 w skali McFerlanda (co odpowiada gęstości komórek 1,5 × 108 × 1 ml^-1). Uzyskane zawiesiny poszczególnych mikroorganizmów dodawano do sterylnych, upłynnionych podłoży mikrobiologicznych, przeznaczonych do hodowli bakterii (PCA, BIH), drożdżaków (SGA) i grzybów pleśniowych (MEA). Następnie rozlewano je na Płytki Petriego. Po zastygnięciu na płytkach układano krążki bibułowe (o Ǿ=6mm) nasączone 5 µl olejku goździkowego. Czas nasączania wynosił 1-2 min. Płytki wraz z nałożonymi krążkami inkubowano przez 24-48h w temperaturze 37^oC (bakterie i drożdżaki) lub 25^oC (grzyby pleśniowe). Po upływie tego okresu czasu, określano strefy zahamowania wzrostu w mm. Wszystkie doświadczenia wykonano w trzech powtórzeniach.

W Tabeli 1 przedstawiono strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów wokół krążków nasączonych olejkiem goździkowym wyodrębnionym z pąków kwiatowych goździkowca korzennego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta.

Tabela 1. Strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów wokół krążków nasączonych olejkiem goździkowym i wodą

2.3. Otrzymywanie kremów z dodatkiem różnej ilości olejku goździkowego

Próbki kremów zawierających różne ilości olejku goździkowego przygotowano w następujący sposób: w pojemniku plastikowym umieszczono w następującej kolejności: wosk pszczeli (1,000 g), cholesterol (1,500 g) oraz wazelinę białą (31,000 g), a następnie wszystkie wprowadzone składniki roztopiono na łaźni wodnej. Po zestawieniu pojemnika z łaźni wodnej, mieszając, dodawano wodę destylowaną (50,000 g). Następnie z  otrzymanego kremu przygotowywano próbki kremu, do których dodawano różne ilości olejku goździkowego. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 2.

Tabela 2. Skład próbek kremów zawierającego różne ilości olejku goździkowego

2.4. Ocena czystości mikrobiologicznej próbek kremów zawierających różne ilości olejku goździkowego

Ocenę czystości mikrobiologicznej próbek kremów, zawierających różne ilości olejku goździkowego wyodrębnionego z materiału roślinnego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, przeprowadzano według następującej procedury: na sterylne podłoże przeznaczone do hodowli bakterii tlenowych i beztlenowych oraz grzybów: MEA, PDA, PCA, kazeinowo-sojowe (PB2) oraz MacConkey’a (MCA) za pomocą jałowej ezy, o wielkości oczka 10 µl rozprowadzano próbki kremu po powierzchni agaru. Płytki inkubowano przez 48h, w temperaturach: 25 i 37⁰C. Następnie określano ilość kolonii grzybów i bakterii. Wyniki podawano jako CFU/ml. Kremy zostały poddane trzykrotnym badaniom czystości mikrobiologicznej: w pierwszym tygodniu po wytworzeniu, po trzech miesiącach oraz po dwunastu miesiącach. Doświadczenia wykonano w trzech powtórzeniach dla każdego typu podłoża i kremu zawierającego różne ilości olejku goździkowego. Ponadto wykonano również badania czystego kremu, nie zawierającego olejku goździkowego. W okresie pomiędzy badaniami, kremy przechowywano w lodówce, w temperaturze 4⁰C.

3. WNIOSKI

Badania nad wyodrębnianiem olejku eterycznego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego (pochodzących z Indonezji - Azja Południowo-Wschodnia) metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, umożliwiły uzyskanie olejku goździkowego zawierającego jako główny składnik eugenol - Rysunek 1. Ponadto w wyodrębnionym olejku goździkowym zidentyfikowano metodą chromatografii gazowej również inny związek terpenowy - kariofilen (Rysunek 1). Porównując uzyskane wyniki badań z wynikami opisanymi w literaturze, można stwierdzić, że skład wyodrębnionego olejku goździkowego zależy od pochodzenia surowca roślinnego [1-5].  W związku z tym wyodrębniony olejek goździkowy może wykazywać różną aktywność wobec mikroorganizmów.

W przeprowadzonej wstępnej ocenie przeciwdrobnoustrojowej czystego olejku goździkowego wyodrębnionego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta wykazano, że bakterie (Escherichia coli i Staphyloccocus epidermidis) i drożdżaki (Candida albicans) wykazują większą wrażliwość na olejek eteryczny niż badane grzyby pleśniowe (Penicillium chrsyogenum i Aspergilllus niger). Uzyskane wyniki badań zestawiono w Tabeli 1.

Na podstawie analizy wyników przedstawionych w Tabeli 1 można uszeregować badane mikroorganizmy pod względem ich wrażliwości na olejek goździkowy: drożdżaki (Candida  albicans) > bakterie gram ujemne (Escherichia coli) > bakterie gram dodatnie (Staphyloccocus epidermidis) > grzyby pleśniowe (Penicillium chrysogenum, Aspergilllus niger).

W przypadku grzybów pleśniowych nie udało się wyróżnić wyraźnych stref zahamowania wzrostu, natomiast zaobserwowano znaczące opóźnienie zarodnikowania (w normalnych warunkach dojrzałe zarodniki obserwuje się po 48h, w przypadku olejku goździkowego po 72h) oraz widoczne osłabienie zarodnikowania (duże połacie grzybni pozbawionej zarodników).

Antybakteryjne działanie eugenolu będącego głównym składnikiem olejku goździkowego potwierdzają wyniki uzyskane przez innych autorów [2]. Natomiast w literaturze przedmiotu eugenol opisywany jest również jako silny fungicyd, stosowany w rolnictwie [3]. Uzyskaną rozbieżność w aktywności przeciwgrzybicznej można powiązać ze źródłem oraz z metodą uzyskania olejku eterycznego. Należy również zbadać wpływ takich czynników, jak: wiek, warunki uprawy rośliny, a także warunki klimatyczne (np. nasłonecznienie). Jak wynika z badań Adaszyńskiej i współpracowników [15] jest to niezwykle istotny czynnik przy porównywaniu właściwości antymikrobiologicznych oraz wyznaczaniu potencjalnych zastosowań olejku.

W badaniach czystości mikrobiologicznej przeprowadzonych dla próbek kremu zawierającego od 0,033 do 0,833% wag. olejku goździkowego, w pierwszym tygodniu po wytworzeniu, po 3 miesiącach i po 12 miesiącach przechowywania nie stwierdzono wzrostu bakterii tlenowych i beztlenowych oraz grzybów na żadnym z badanych podłoży. Świadczy to o dużej stabilności mikrobiologicznej uzyskanych preparatów. Ponieważ stężenie olejku goździkowego w badanych próbkach kremu było niskie (od 0,033 do 0,833% wag.), należy przypuszczać, że na trwałość kremów wpływ miały również inne jego składniki np. wosk pszczeli obecny w ich składzie.

Obecny, intensywny rozwój badań nad substancjami przeciwdrobnoustrojowymi budzi nadzieję, że dobrze znane olejki eteryczne mogą stać się ważną grupą substancji o znaczeniu konserwującym.

4. LITERATURA

[1]    C.W. Gayoso, E.O. Lima, V.T. Oliveira i in., Sensitivity of fungi isolated from onychomycosis to Eugenia cariophyllata essential oil and eugenol, 2005, Fitoterapia, 76, 247-249
[2]    G.P. Kamatou, I. Vermaak, A.M. Viljoen, Eugenol-from the remote maluku islands to the International market place: A review of a remarkable and versatile molecule, 2012, Molecules, 17, 6953-6981
[3]    G.A. Ayoola, F.M. Lawore, T. Adelowotan i in., Chemical analysis and antimicrobial activity of the essential oil of Syzygium aromaticum (clove), 2008, African Journal of Microbiology Research, 2, 162-166
[4]    S. Chao, G. Young, C. Oberg i in., Inhibition of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) by essential oils, 2008, Flavour and Fragrance Journal, 23, 444-449
[5]    D. Fabian, M. Sabol, K. Domaracka i in., Essential oils - their antimicrobial activity against Escherichia coli and effect on intestinal cell viability, 2006, Toxicology in Vitro, 20, 1435-1445
[6]    A. Fabio, C. Cermelli, G. Fabio i in., Screening of the antibacterial effects of a variety of essentials oils on microorganisms responsible for respiratory infections, 2007, Phytotherapy Research, 21, 374-377
[7]    M. De, A.K. De, A.B. Banerjee, Antimicrobial screening of some Indian species, 1999, Phytotherapy Research, 13, 616-618
[8]    A. Kędzia, Ocena działania przeciwbakteryjnego olejku goździkowego (Oleum Caryophylli), 2007, Postępy Fitoterapii, 2, 66-70
[9]    N. Rusenova, P. Parvanov, Antimicrobial activities of twelve essential oils agains microorganisms of veterinary importance, 2009, Trakia Journal of Sciences, 7(1), 37-43
[10]    N. Mytle, G.L. Anderson, M.P. Doyle i in., Antimicrobial activity of clove (Syzygium aromaticum) oil in inhibiting Listeria monocytogenes on chicken frankfurters, 2006, Food Control, 17, 102-107
[11]    S. Saeed, P. Tariq, In vitro antibacterial activity of clove against Gram-negative bacteria, 2008, Pakistan Journal of Botany, 40(5), 2157-2160
[12]    V. Tulio, A. Nostro, N. Mandras i in., Antifungal activity of essential oils against filamentous fungi determined by broth microdilution and vapour contact methods, 2006, Journal of Applied Microbiology, 102, 1544-1550
[13]    H.S. Ali, M. Kamal, S.B. Mohamed, In vitro clove oil activity against periodontopathic bacteria, 2009, Journal of Science Education and Technology, 10(1), 1-7
[14]    A.M. Janssen, N.L.J. Chin, J.J.C. Scheffer i in., Screening for antimicrobial activity of some essential oils by the agar oveley technique, 1986, Pharmaceutisch Weekblad Scientific Edition, 8, 289-292
[15]    M. Adaszyńska, M. Swarcewicz, A. Markowska-Szczupak, Porównanie składu chemicznego i aktywności przeciwdrobnoustrojowej olejku eterycznego otrzymanego z różnych krajowych odmian lawendy wąskolistnej (Lavendula angusifolia L.), 2013, Postępy Fitoterapii, XIV/2, 90-96