Ocena aktywności antyoksydacyjnej próbek kremu zawierających olejek goździkowy metodą redukcji rodnika DPPH
Edyta Makuch(1), Agnieszka Wróblewska(1), Łukasz Kucharski(2), Adam Klimowicz(2)
(1) Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, Wydział Technologii
i Inżynierii Chemicznej, Instytut Technologii Chemicznej Organicznej, ul. Pułaskiego 10,
70-322 Szczecin
(2) Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Wydział Nauk o Zdrowiu, Katedra i Zakład Chemii Kosmetycznej i Farmaceutycznej, ul. Powstańców Wielkopolskich 72,
70-111 Szczecin
STRESZCZENIE
Celem pracy był pomiar właściwości antyoksydacyjnych próbek kremu z dodatkiem różnych ilości olejku goździkowego, wyodrębnionego z materiału roślinnego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta. Surowiec do badań stanowiły pąki kwiatowe goździkowca korzennego firmy: Prymat (pochodzące z Indonezji - Azja Południowo-Wschodnia) oraz Kamis (pochodzące z wyspy Madagaskar - Afryka Południowo-Wschodnia). Potencjalną zdolność antyoksydacyjną próbek kremu wyznaczono w procentach, metodą redukcji wolnego rodnika DPPH, z wykorzystaniem roztworu DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazylu) oraz przy użyciu spektrofotometru Merck Spectroquant Pharo 300. Jako wzorzec do sporządzenia krzywej kalibracji wykorzystano pochodną witaminy E występującą pod nazwą handlową Trolox (kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy).
1. WSTĘP
Najważniejszymi reaktywnymi formami tlenu są: a) tlen cząsteczkowy (O2), wykazujący niską reaktywność, która zwiększa się pod wpływem jonów żelaza i miedzi), b) tlen singletowy (1O2), będący formą tlenu cząsteczkowego występującego na najniższym stanie wzbudzonym, c) anionorodnik ponadtlenkowy (O2.-), powstający w wyniku przeniesienia elektronu na tlen cząsteczkowy, d) nadtlenek wodoru (H2O2), powstający w wyniku redukcji tlenu cząsteczkowego, e) rodnik hydroksylowy (HO·), f) tlenek azotu (NO·), g) anion kwasu nadtlenoazotawego (ONOO-) oraz h) rodniki alkoksylowe (RO·, ROO·) [1].
Wolne rodniki są istotnymi czynnikami procesu starzenia się organizmu oraz wielu chorób ogólnoustrojowych. Nieodpowiednia dieta, niewłaściwe przyrządzanie i przechowywanie żywności oraz zanieczyszczenie środowiska, to przyczyny dostarczania organizmowi wielu ksenobiotyków, a także wolnych rodników [2].
Największą grupę związków zaliczaną do naturalnych antyoksydantów stanowią polifenole, występujące w łodygach, liściach i owocach prawie wszystkich roślin. Ze względu na budowę szkieletu węglowego wyróżnia się następujące podgrupy tych związków: a) kwasy hydroksybenzoesowe, b) kwasy hydroksycynamonowe i kumaryny, c) naftochinony, d) ksantony, e) stilbeny i f) flawonoidy [1,2]. Te ostatnie, ze względu na różnorodność budowy i wielokierunkowość aktywności biologicznej, stanowią najcenniejszą podgrupę związków, która jest zaliczana do polifenoli. Obecność tych związków wykazano między innymi w owocach, warzywach, roślinach strączkowych, a także w licznych roślinach leczniczych [3]. Polifenole dzięki obecności w szkielecie kilku grup hydroksylowych wykazują silne właściwości przeciwutleniające, gdyż zdolności antyoksydacyjne wzrastają wraz z ilością grup hydroksylowych, występujących w szkielecie związku, a także zmieniają się w zależności od położenia tych grup [4].
Działanie przeciwutleniające antyoksydanów można opisać różnymi mechanizmami, gdyż związki te: I) mogą oddawać elektron lub atom wodoru wykazując właściwości redukujące, II) mogą stabilizować i delokalizować niesparowany elektron, III) mogą chelatować jony metali enzymów katalizujących reakcje utleniania, IV) mogą być inhibitorem oksydaz, V) mogą być terminatorem przerywającym łańcuchowe reakcje rodnikowe, a także VI) mogą być stabilizatorem wolnych rodników, powstających w reakcjach oksydacyjnych [4].
W badaniach nad skutecznością antyoksydantów wykorzystano ich zdolność do dezaktywacji wolnych rodników. Jedną z metod pomiaru zdolności przeciwutleniającej jest metoda z użyciem odczynnika DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl). Odczynnik DPPH jest stabilnym wolnym rodnikiem posiadającym niesparowany elektron na powłoce walencyjnej. W roztworze etanolowym ten stabilny kationorodnik posiada ciemnofioletową barwę przy maksimum absorbancji oraz przy długości fali λ = 517 nm. W reakcji z substancją wykazującą potencjalne zdolności przeciwutleniające rodnik DPPH oddając atom wodoru, tworzy na jednym z atomów azotu tzw. mostek azotowy, w wyniku czego przechodzi w formę zredukowaną DPPH. Wówczas zanika fioletowe zabarwienie roztworu, co prowadzi do obniżenia się absorbancji roztworu [5,6].
Olejek goździkowy (Oleum caryophylli) wyodrębniony z materiału roślinnego zawiera głównie związki terpenowe, takie jak: eugenol (4-allilo-2-metoksyfenol), który jest głównym składnikiem, kariofilen (2-metyleno-6,10,10-trimetylo-bicyklo-[7,2,0]-imdec-5-en), α-pinen (2,6,6-trimetylo-bicyklo-[3,1,1]-hept-2-en), ß-pinen (6,6-dimetylo-2-metylenobi-cyklo-[3,1,1]-heptan) oraz limonen (4-izopropenylo-1-metylocykloheksen) [7,8].
Z danych literaturowych wynika, że olejek goździkowy wykazuje właściwości przeciwdrobnoustrojowe (antyseptyczne, przeciwbólowe oraz grzybobójcze) [9-11]. Natomiast nasze wcześniejsze badania wykazały, że olejek goździkowy wyodrębniony z materiału roślinnego metodą: ekstrakcji w aparacie Soxhleta, destylacji prostej, ekstrakcji przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz metodą z użyciem ultradźwięków wykazuje również właściwości antyoksydacyjne [12]. Najwyższą zdolnością zmiatania wolnych rodników zmierzoną przy użyciu roztworu DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl, Sigma-Aldrich) charakteryzował się olejek goździkowy wyodrębniony z materiału roślinnego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta (87,33%). Natomiast olejki goździkowe wyodrębnione metodą: destylacji prostej, ekstrakcji przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz metodą z użyciem ultradźwięków wykazywały następującą zdolność redukcji rodnika DPPH: 78,25; 60,75 i 46,58%.
Przeprowadzone badania nad wyodrębnianiem związków naturalnych z materiałów roślinnych wykazały, że najwyższą zdolnością antyoksydacyjną charakteryzowały się związki wyodrębnione z materiału roślinnego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta. Dlatego też różne ilości olejku goździkowego wyodrębnionego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego (firmy: Prymat i Kamis) tą metodą, a następnie osuszonego na sitach molekularnych 4Å, wprowadzano do specjalnie przygotowanego kremu, w celu pomiaru jego potencjalnej zdolności antyoksydacyjnej.
2. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA I WYNIKI
2.1. Wyodrębnianie olejku goździkowego z materiału roślinnego
Wyodrębnianie olejku goździkowego z pąków kwiatowych goździkowca korzennego firm: Prymat (pochodzących z Indonezji - Azja Południowo-Wschodnia) oraz Kamis (pochodzących z Madagaskaru - Afryka Południowo-Wschodnia), metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta przeprowadzono zgodnie z procedurą opisaną w naszej wcześniejszej publikacji [12].
2.2. Oznaczanie zawartości wody w olejku goździkowym metodą Karla-Fishera
Zawartość wody w olejkach goździkowych wyodrębnionym z pąków kwiatowych goździkowca korzennego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, oznaczono metodą kulometryczną na aparacie Coulometer 831 KF Metrohm, przy użyciu odczynnika HYDRANAL - Coulomat AG (Fluka).
2.3. Identyfikacja jakościowa olejku goździkowego metodą chromatografii gazowej
Identyfikację jakościową olejków goździkowych, wyodrębnionych z pąków kwiatowych goździkowca korzennego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, przeprowadzono metodą chromatografii gazowej GC, na aparacie FOCUS (Thermo Electron) z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym FID oraz przy zastosowaniu kolumny kapilarnej ZEBRON ZB-WAXplus (0,32 mm x 30 m x 0,5 µm), z wypełnieniem w postaci glikolu polietylenowego i autosamplera. Parametry pracy aparatu były następujące: ciśnienie helu 60 kPa, temperatura komory próbek 200oC, temperatura detektora 250oC, temperatura termostatu narastała według następującego programu: izotermicznie 60oC przez 0 minut, wzrost temperatury z szybkością 10oC/min, izotermicznie 240oC przez 4 minuty, chłodzenie do 60oC, czułość 10 i objętość dozowanej próbki 0,5 μl.
Na Rysunku 1 przedstawiono chromatogramy olejków goździkowych wyodrębnionych z pąków kwiatowych goździkowca korzennego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz jego wzorzec (eugenol, Sigma-Aldrich), będący głównym składnikiem tych olejków.
Rys. 1. Chromatogramy olejków goździkowych wyodrębnionych z pąków kwiatowych goździkowca korzennego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz jego wzorzec (eugenol)
2.3. Badania olejku goździkowego metodą spektroskopii w podczerwieni
W celu ustalenia rodzaju grup funkcyjnych występujących w analizowanych próbkach olejku goździkowego wyodrębnionych metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, wykonano badania metodą spektroskopii w podczerwieni (IR). Do badań tą metodą zastosowano aparat JASCO FT/IR-430. Badania przeprowadzono w KBr, z którego najpierw wykonano pastylkę, a następnie na jej powierzchni nanoszono badaną próbkę olejku goździkowego. W celu rejestracji widma pastylkę z naniesionym olejkiem umieszczano w uchwycie z okienkami przepuszczalnymi dla podanej długości fali promieniowania IR. Parametry pracy aparatu były następujące: zakres pomiaru 1500-400 cm-1, czułość 50, a próg bezwzględny 85,833. Tą samą metodą, w celach porównawczych wykonano również badania eugenolu, będącego głównym składnikiem olejku goździkowego.
Na Rysunku 2 przedstawiono widma IR olejków goździkowych wyodrębnionych z pąków kwiatowych goździkowca korzennego, metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz eugenolu. Uzyskane widma IR były zgodne z danymi literaturowymi [13].
Rys. 2. Widma IR olejków goździkowych wyodrębnionych z materiału roślinnego metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz eugenolu
W Tabeli 1 przedstawiono rodzaje grup funkcyjnych oraz wiązań chemicznych wyznaczonych: dla dwóch badanych olejków goździkowych wyodrębnionych metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz dla eugenolu.
Tabela 1. Rodzaje grup funkcyjnych wyznaczone dla olejków goździkowych wyodrębnionych metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta oraz dla eugenolu
2.4. Pomiar zdolności antyoksydacyjnej próbek kremu z dodatkiem olejku goździkowego metodą redukcji rodnika DPPH
Właściwości przeciwutleniające próbek kremu z dodatkiem różnej ilości olejków goździkowych wyodrębnionych z pąków kwiatowych goździkowca korzennego (firmy Prymat i Kamis) metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, oznaczano zmodyfikowaną metodą opisaną przez Branda-Wiliamsa i współpracowników [14]. Badania wykonano metodą spektroskopii na aparacie Merck Spectroquant Pharo 300, przy długości fali λ = 517 nm, po uprzedniej 10-cio minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Pomiar zdolności antyoksydacyjnej wykonywano za pomocą syntetycznego rodnika DPPH (2,2-difenylo-2-pikrylohydrazyl, Sigma Aldrich), który rozcieńczano alkoholem etylowym (cz.d.a., Chempur). Roztwór DPPH przygotowywano rozpuszczając 2,2-difenylo-2-pikrylohydrazyl w alkoholu etylowym do momentu uzyskania absorbancji przy długości fali λ = 517 nm wynoszącej około 1,000.
W celu kalibracji spektrofotometru sporządzono krzywą kalibracyjną w Troloxie (6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy, 97%, Sigma Aldrich), stosując alkohol etylowy jako rozpuszczalnik.
W Tabeli 2 przedstawiono dane do krzywej wzorcowej Troloxu w etanolowym roztworze.
Tabela 2. Krzywa wzorcowa Troloxu w etanolowym roztworze
Na Rysunku 3 przedstawiono krzywą kalibracji dla Troloxu w alkoholu etylowym jako rozpuszczalniku.
Rys. 3. Krzywa kalibracji dla Troloxu
W celu przeprowadzenia pomiaru zdolności antyoksydacyjnej próbek kremu z dodatkiem różnych ilości olejku goździkowego w pierwszej kolejności rozpuszczano 1,000 g próbki w 10 cm3 acetonu, po czym całość mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego do uzyskania klarownego roztworu. Następnie 150 µl uzyskanego klarownego roztworu wprowadzano do sporządzonego etanolowego roztworu DPPH o odpowiedniej absorbancji i wykonywano pomiar. Każdą badaną próbkę kremu zawierającą różne ilości olejku goździkowego badano trzykrotnie, a następnie obliczano średnią wartość absorbancji. Wykonano również pomiar potencjalnej zdolności przeciwutleniającej próbki czystego kremu, nie zawierającego olejku goździkowego.
Potencjalną zdolność badanych próbek do przeciwdziałania reakcji utleniania obliczano według poniższego wzoru [5]:
Procent zmiatania rodnika DPPH [%] = [(A0 - A1)/A0] * 100%
A0 - absorbancja etanolowego roztworu rodnika DPPH,
A1 - absorbancja etanolowego roztworu rodnika DPPH zawierającego acetonowy roztwór analizowanej próbki.
Uzyskane wyniki badań przedstawiono w Tabeli 3.
Tabela 3. Pomiar zdolności antyoksydacyjnej próbek kremu z dodatkiem różnych ilości olejków goździkowych (firmy Prymat i Kamis) oraz próbki czystego kremu, nie zawierającego olejku goździkowego
3. WNIOSKI
Badania nad wyodrębnianiem olejków goździkowych z pąków kwiatowych goździkowca korzennego (firmy Prymat i Kamis) metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, umożliwiły uzyskanie obu olejków goździkowych z wydajnością około 6,4% (w przeliczeniu na 10,0 g użytego materiału roślinnego). Ponadto olejki te zawierały około 0,04% wag. wody oznaczonej metodą Karla-Fishera.
Identyfikacja jakościowa olejku eterycznego wyodrębnionego z pąków kwiatowych goździkowca firmy Prymat i przeprowadzona metodą chromatografii gazowej pokazała, że głównym składnikiem tego olejku był eugenol (97,97%), natomiast w niewielkich ilościach olejek ten zawierał również kariofilen (1,99%) - Rysunek 1. Natomiast jedynym składnikiem olejku goździkowego wyodrębnionego z materiału roślinnego firmy Kamis był eugenol (Rysunek 1.).
Przeprowadzone badania nad wyodrębnianiem związków naturalnych z materiałów roślinnych pokazały, że skład wyodrębnionego olejku zależy od pochodzenia surowca roślinnego. W przypadku olejku goździkowego wyodrębnionego z wysuszonych pąków kwiatowych goździkowca korzennego (Eugenia caryophyllata) pochodzących z Madagaskaru zidentyfikowano dwa składniki: eugenol i kariofilen. Natomiast w przypadku użycia pąków kwiatowych goździkowca korzennego pochodzących z Indonezji, jedynym związkiem zidentyfikowanym metodą chromatografii gazowej w wyodrębnionym olejku był eugenol. W związku z tym olejki te mogą wykazywać różną zdolność do reagowania z rodnikiem DPPH.
Przeprowadzone badania metodą spektroskopii w podczerwieni pozwoliły zidentyfikować główne grupy funkcyjne występujące w analizowanych próbkach olejków goździkowych: a) fenolowe grupy O–H, pochodzące od cząsteczki eugenolu i występujące przy długości fali 3300-3600 cm-1, b) grupy C–H występujące w strukturze eugenolu i kariofilenu przy długości fali 3850-3100 cm-1, c) pasma kombinatoryjne potwierdzające 1,2,4- podstawiony pierścień pochodzący od eugenolu i występujące przy długości fali 1760-1665 cm-1 oraz d) grupy C=C występujące zarówno w cząsteczce eugenolu jak i w cząsteczce kariofilenu przy długości fali 1500-2000 cm-1 - Tabela 1. Uzyskane widma IR były zgodne z danymi literaturowymi [13].
W przypadku próbek kremów zawierających te same ilości olejku goździkowego, lecz różniących się pochodzeniem surowca roślinnego, z którego pozyskano dany olejek, nie zaobserwowano różnicy w stopniu redukcji wolnego rodnika DPPH. Powodem tego może być identyczna ilość grup hydroksylowych (-OH) obecnych w olejkach goździkowych wyodrębnionych z materiału roślinnego firm Prymat i Kamis.
Badania pomiaru potencjalnej zdolności przeciwutleniającej próbek kremów zawierających różne ilości dwóch olejków goździkowych wyodrębnionych z wysuszonych pąków kwiatowych goździkowca korzennego firm Prymat i Kamis metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta, wykazały różną skuteczność do reagowania z rodnikiem DPPH tych kremów. Analizowane próbki kremu zawierały od 0,033 do 0,833% wag. dwóch badanych olejków goździkowych. Ponadto przeprowadzono również badania potencjalnej zdolności zmiatania rodnika DPPH czystego kremu nie zawierającego olejku goździkowego. Uzyskanie wyniki pokazały, że czysty krem (nie zawierający olejku goździkowego) charakteryzował się stopniem zmiatania rodnika DPPH równym 6,74%. Natomiast wraz ze zwiększaniem ilości olejku goździkowego od 0,033 do 0,666% w badanym kremie wzrastała jego zdolność do zmiatania rodnika DPPH od 30,62-30,63 do 95,91-95,92%. Tak wysoki procent inhibicji (95,91-95,92%) wskazuje na silne właściwości antyoksydacyjne badanych próbek kremów i oznacza jednocześnie małą pozostałość nieprzereagowanego rodnika DPPH w próbce. Natomiast dalsze zwiększanie ilości olejku goździkowego wprowadzanego do kremu (0,833% wag.) nie miało już wpływu na wartość stopnia zmiatania wolnego rodnika DPPH, który wynosił 95,71-95,73%.
W literaturze istnieje szereg metod badawczych znajdujących zastosowanie w ocenie potencjału przeciwutleniającego związków naturalnych wyodrębnianych z roślin. Jednak metoda oceny pomiaru zdolności przeciwutleniającej wykorzystująca odczynnik DPPH charakteryzuje się powtarzalnością, eliminuje czynniki wpływające na powstawanie błędów pojawiających się przy pomiarach in vivo oraz jest mniej kosztowna w porównaniu z tradycyjnymi metodami in vivo [15].
4. LITERATURA
[1] O.I. Aruoma, Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods, 2003, Mutation Research, 523-524, 9-20
[2] S. Ball, Antyoksydanty w medycynie i zdrowiu człowieka, 2001, Medyk, wyd. 1, Warszawa
[3] A. Krasowska, M. Łukaszewicz, Czy warto jeść kolorową żywność, 2003, Aura, 2, 20-21
[4] C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga, Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids, 1996, Free Radical Biology and Medicine, 20(7), 933-956
[5] P. Molyneux, The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity, 2004, Journal of Science and Technology, 26, 211-219
[6] R. Wołosiak, M. Rudny, E. Skrobek i in., Charakterystyka aromatu i właściwości przeciwutleniających wybranych naparów używek i ziół, 2007, Żywność Nauka Technika Jakość, 3(52), 109-118
[7] K. Chaieb, H. Hajlaoui, T. Zmantar i in., The Chemical Composition and Biological Activity of Clove Essential Oil, Eugenia caryophyllata (Syzigium aromaticum L. Myrtaceae): A Short Review, 2007, Phytotherapy Research, 21, 501-506
[8] A. Kędzia, A. Kusiak, B. Kochańska i in., Aktywność preparatu Aromatol wobec bakterii beztlenowych, 2015, Postępy Fitoterapii, (16)4, 210-215
[9] J. Kovács, G. Horváth, M. Kerényi i in., A modified bioautographic method for antibacterial component screening against anaerobic and microaerophilic bacteria, 2016, Journal of Microbiological Methods, 123, 13-17
[10] H. Majeed, F. Liu, J. Hategekimana i in., Bactericidal action mechanism of negatively charged food grade clove oil nanoemulsions, 2016, Food Chemistry, 197, 75-83
[11] P.L. Nuñez, M. Aquino, Microbicide activity of clove essential oil (eugenia caryophyllata), 2012, Brazilian Journal of Microbiology, 1255-1260
[12] E. Makuch, A. Wróblewska, Ł. Kucharski i in., Pomiar całkowitej zdolności antyoksydacyjnej olejku goździkowego metodą redukcji rodnika DPPH, Folina-Ciocalteu’a oraz FRAP, 2016, I Szczecińskie Sympozjum Młodych Chemików, 31-33
[13] S. Cunha, D. Machado Lustosa, Nathan Dias Conceição, Biomassa em aula prática de química orgânica verde: cravo-da-índia como fonte simultânea de óleo essencial e de furfural, Quim. Nova, 2012, 35(3), 638-641
[14] W. Brand-Williams, M.E. Cuvelier, C. Berset, Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity, 1995, Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 28, 25-30
[15] J. Kiewlicz, P. Malinowska, H. Szymusiak, Aktywność przeciwrodnikowa wybranych wyciągów ziołowych, 2013, Problemy Higieny i Epidemiologii, 94(2), 317-320
